Van Nistelrroy debutó ante Turquía el 10 de octubre de 1997. Jugó algunos partidos con la selección sub-21 de los Países Bajos. Debutó con la absoluta el 18 de noviembre de 1998 en un empate a un gol contra Alemania. Ha sido internacional 64 veces en las que ha anotado un total de 33 goles. EL año 1999, después de varios amistosos con la selección, una lesión le dejó apartado de la Eurocopa 2000. Tras su lesión, disputó 5 partidos de Clasificación para el Mundial de 2002, jugó 5 partidos y anotó 6 tantos pero Holanda, no logró clasificarse.

En la Eurocopa de 2004 disputó 6 partidos en los que anotó 4 goles y fue el segundo máximo anotador. Holanda fue eliminada en semifinales al caer ante Portugal por 2-1. Fue incluido en el 'Equipo ideal UEFA All-Star'.

En la Copa Mundial de 2006, Van Nistelrooy jugó 10 partidos anotando 7 tantos. Marco van Basten, se enfadó con Ruud debido a una agresión a Ron Vlaar durante un entrenamiento y en el partido ante Andorra recibió una tarjeta amarilla por celebrar un gol delante de un rival con el que habia discutido anteriormente. Su técnico no lo alineó en el partido que perdieron por un gol a cero en los octavos de final ante la selección de Portugal y se hizo público que antes del partido discutió con el entrenador.

A raíz del Mundial, la mala relación entre ellos se agravó, lo que supuso que en los siguientes partidos de la selección no fuese convocado por el seleccionador neerlandés. El 23 de enero de 2007, anunció su retiro de la selección, sin embargo, tras varias conversaciones con Edwin van der Sar y Van Basten, ambos solucionaron sus diferencias. Después de meses, fue convocado de nuevo para defender la camiseta neerlandesa, para disputar un amistoso frente a Suiza, después de haber realizado una buena temporada en el Real Madrid.

Durante la Eurocopa 2008 fue el máximo goleador del equipo junto a su compañero en el Real Madrid Wesley Sneijder y a Robin van Persie, con 2 goles en 3 partidos. Disputaron una magnifica primera fase en la que golearon a Italia (3-0), Francia (4-1) y Rumanía (2-0). Sin embargo, a pesar de un gol suyo que les llevó a la prórroga ante la selección de Rusia, perdieron el encuentro por 3 goles a 1. Tras este encuentro anunció que dejaba la selección por un tiempo debido a la gran carga física que supone disputar partidos con su equipo y su selección. Sin embargo, después anunció que volvería para jugar su último Mundial, si el técnico nacional así lo disponía, aunque finalmente no fue convocado.

Volvió a ser convocado para jugar con su selección tras 2 años para jugar las eliminatorias para la Eurocopa 2012. Disputó unos últimos minutos frente a San Marino, el 3 de septiembre de 2010. El partido iba 4 a 0 a favor de los neerlandeses, cuando Ruud aprovechó un centro para poner el 5 a 0 definitivo. Volvió a ser convocado para enfrentar a Finlandia el 7 de septiembre del mismo año y entró en el minuto 82. El 29 de marzo de 2011 también volvió a ser convocado para jugar contra la selección de Hungría ingresando en el minuto 46 y anotando un gol en el minuto 73 del encuentro. Aunque jugó algún partido en las eliminatorias, el seleccionador anunció meses antes que no sería convocado para jugar la Eurocopa 2012, ya que no tuvo regularidad en el Málaga F.C.